Isolamento de sideróforos produzidos in vitro por mutante de Gluconacetobacter diazotrophicus estirpe PAL5T

Resumo

Gluconacetobacter diazotrophicus é uma bactéria fixadora de nitrogênio e também está envolvida na produção de fatores estimulantes do crescimento vegetal, como no aumento da disponibilidade de ferro através da produção de sideróforos. Estes são pequenas biomoléculas que apresentam alta afinidade pelo íon férrico, sendo capazes de extraí-lo da maioria dos compostos químicos e orgânicos. O ferro é elemento essencial no processo de fixação biológica de nitrogênio, pois está presente nos dois componentes conhecidos como ferro-proteína (Fe-proteína) e ferro-molibdênio proteína (MoFe-proteína), que constituem a enzima nitrogenase, protagonista desse processo. O mutante de G. diazotrophicus estirpe PAL5^T, designado Gdiaa31, foi gerado pela inserção do transposon Tn5 na região promotora do grupo gênico tonB-exB-exbD. Essa região é essencial para a internalização do complexo ferro-sideróforos e consequentemente durante o cultivo in vitro observa-se o acúmulo de sideróforos. O mutante foi cultivado em meio de LGI-P modificado pela adição de 1 g.L^-1 de ácido succínico e 16,8 mL de solução D-glicose a 30% (m/v). Após o crescimento das bactérias, o sobrenadante gerado pela centrifugação à 4.000 rpm e 4°C durante 15 minutos, filtrado e, posteriormente, acidificado com solução de ácido clorídrico a 5% (v/v), para que pudesse ser misturado a 0,4 volume de acetato de etila para a precipitação das moléculas de sideróforos. Essa mistura permaneceu sob homogeneização por cerca de 16 horas e, no dia seguinte foi centrifugada a 6000 rpm e 4°C durante 10 minutos e seu sobrenadante foi recolhido em microtubos para evaporação do líquido no SpeedVac. O método de cromo azurol S (CAS) confirmou a presença de sideróforos antes e depois do isolamento dos mesmos. A quantificação realizada pelo teste de Csáky (1948) mostrou uma concentração de 119,78 µmol.L^-1 de cultivo.